一、細(xì)胞冷凍保存
1.材料：
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)
2、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。
-20℃不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
（1）冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
（3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSOZ后濃度為5～10％），使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1～2ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。
4、注意事項(xiàng)：
（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
（2）細(xì)胞在液氮中可長期凍存時(shí)間，而不會影響細(xì)胞活力；在-70度可保存數(shù)月。
（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如 )，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化，可換用10%甘油凍存。
（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。
③adherent tumor lines:5～7×106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。
（6）凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積（4度時(shí)），復(fù)蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養(yǎng)細(xì)胞，以90%血清凍存更為有效。
二、冷凍細(xì)胞活化
1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2、細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3、材料
37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器
4、步驟：
（1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。
（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。
（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測試
1、原理：
（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_盼蘭對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)；計(jì)數(shù)器(counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）。
3、步驟：
（1）取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
（2）取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish)。
（3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，Z后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，Z適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
5、范例：
T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55，62，49，59；死細(xì)胞數(shù)/方格：5，3，4，6；細(xì)胞總數(shù)=243
平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75；稀釋倍數(shù)=2；
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106；
細(xì)胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%