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第六節(jié) 無(wú)蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一、無(wú)蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）：即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)終要應(yīng)用于人體，如果再生長(zhǎng)過(guò)程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過(guò)程就比較復(fù)雜，終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無(wú)蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無(wú)蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基。人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞

二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM)：是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM問(wèn)世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

T-47D細(xì)胞，人乳腺管癌細(xì)胞

CCD-1095Sk細(xì)胞，人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌旁皮膚細(xì)胞

SK-BR-3*細(xì)胞，人乳腺腺癌細(xì)胞

SW 1353細(xì)胞，人軟骨肉瘤細(xì)胞

GNM 細(xì)胞，人上頜牙齦癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞

T6細(xì)胞，人舌癌細(xì)胞

TSCCA細(xì)胞，人舌鱗癌細(xì)胞

CAL 27細(xì)胞，人舌鱗癌細(xì)胞

Tca-8113細(xì)胞，人舌鱗癌細(xì)胞

TSCCa細(xì)胞，人舌鱗癌細(xì)胞

CRT 細(xì)胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

U251細(xì)胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

SH-SY5Y細(xì)胞，人神經(jīng)瘤細(xì)胞

BE(2)-M17細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

CRL-2268細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

IMR-32細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

SH-5Y5Y細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

SK-N-AS細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

SK-N-BE(2)細(xì)胞，人神經(jīng)母瘤細(xì)胞

SK-N-MC細(xì)胞，人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞

A-498細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞

A498-EGFP-puro細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞

ACHN細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞

KC細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞

OS-RC-2細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞

G-401細(xì)胞，人腎癌Wilms細(xì)胞

SK-NEP-1細(xì)胞，人腎母瘤細(xì)胞

SW-13細(xì)胞，人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞

NCI-H295R細(xì)胞，人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞

KP-N-NS細(xì)胞，人腎上腺神經(jīng)母瘤(腦轉(zhuǎn)移)細(xì)胞

NCI-H205細(xì)胞，人腎上腺腺瘤細(xì)胞

786-O(786-0)細(xì)胞，人腎透明癌細(xì)胞

CaKi-1細(xì)胞，人腎透明癌細(xì)胞

CaKi-2細(xì)胞，人腎透明癌細(xì)胞

786-0細(xì)胞，人腎透明腺癌細(xì)胞

ACHN細(xì)胞，人腎透明腺癌細(xì)胞

769-P細(xì)胞，人腎腺癌細(xì)胞

HuTu-80細(xì)胞，人十二脂腸腺癌細(xì)胞

CaES-17細(xì)胞，人食管癌細(xì)胞第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO₂ 的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用于5%CO₂的環(huán)境，若放入CO₂培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca²⁺、Mg²⁺，應(yīng)當(dāng)先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見(jiàn)有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過(guò)濾除菌。過(guò)濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過(guò)濾除菌，分裝于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來(lái)解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的佳pH為6.5。膠原酶不受Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。

三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO₃溶液。

1、NaHCO₃溶液：NaHCO₃是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說(shuō)明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO₂的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO₂的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說(shuō)明書所要求加入NaHCO₃。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO₂的環(huán)境，CO₂ 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時(shí)應(yīng)加溫30℃，完全溶解后過(guò)濾除菌，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于－20℃。使用時(shí)，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解；需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過(guò)程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開(kāi)蓋子，增加了破壞無(wú)菌狀態(tài)的可能性；

（2）過(guò)多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是優(yōu)替代物，它無(wú)需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞