96T人層連蛋白/板層素(LN)ELISA Kit

　　上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，是一家專(zhuān)注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的高科技企業(yè)，是國(guó)內(nèi)代理銷(xiāo)售生物試劑、儀器的知名公司之一。公司本著為顧客服務(wù)、為科研服務(wù)的宗旨，為中國(guó)的專(zhuān)家和學(xué)者提供種類(lèi)齊全的高品質(zhì)產(chǎn)品。希美公司已與多家歐美著名生物技術(shù)公司簽訂獨(dú)家或區(qū)域代理協(xié)議，銷(xiāo)售的實(shí)驗(yàn)儀器、消耗品、分子生化試劑、免疫試劑和細(xì)胞培養(yǎng)試劑等，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、開(kāi)發(fā)應(yīng)用、制藥、疾病診斷與控制、人口與健康、生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域?？蛻?hù)遍布大學(xué)、研究所、醫(yī)院、衛(wèi)生防疫、商品檢驗(yàn)檢疫、制藥公司、生物技術(shù)公司和食品工業(yè)等單位。主要產(chǎn)品包括：英國(guó)Randox-lifesciences公司的藥物殘留ELISA試劑盒、抗體抗體蛋白;挪威Biosese公司的檢測(cè)表面活性劑、農(nóng)藥殘留、毒素、PCB等相關(guān)有害物質(zhì)的ELISA檢測(cè)試劑盒以及魚(yú)類(lèi)蛋白和抗體;Gibco公司DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基、F10培養(yǎng)基等;Prospec-Tany公司的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、蛋白激酶、重組和天然蛋白、酶以及病毒抗原和抗體;美國(guó)eBioscience公司的流式細(xì)胞術(shù)產(chǎn)品等。

　　高創(chuàng)的宗旨是：為用戶(hù)提供“最高質(zhì)量的產(chǎn)品” 和 “最優(yōu)質(zhì)的服務(wù)”。

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人層連蛋白/板層素(LN)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

檢測(cè)范圍：7.8 ng/ml - 500 ng/ml
zui低檢測(cè)限：1.95 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人LN，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
有效期：6個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中LN含量。
說(shuō)明
1．試劑盒保存：-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí))；2-8℃(頻繁使用時(shí))。
2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗LN抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗LN抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的LN呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96孔)。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)：2瓶(凍干品)。
3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。
5. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)
7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)
8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為500 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制250 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml(不要少于0.5ml)500 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100μl)，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100μl)，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl(取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液) 100μl，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色(30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
注：
1. 用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是后加底物溶液及2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請(qǐng)避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。