人ELISA的實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟

  一、實(shí)驗(yàn)原理

  ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體—聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

  二、實(shí)驗(yàn)材料

  1、試劑

  (1)包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

  NaCO3：1.59克、NaHCO3：2.93克，加蒸餾水至1000ml

  (2)洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸餾水至1000ml

  (3)稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10%使用。

  (4)終止液(2M H2SO4)：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。

  (5)底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸)：0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml 0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。

  (6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml無(wú)水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml 0.75% H2O232μl

  (7)ABTS使用液：ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3% H2O2 2μl

  (8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

  (9)正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。

  2、器材:

  (1)聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

  (2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

  (3)4℃冰箱，37℃孵育箱。

  三、實(shí)驗(yàn)步驟

  (一)用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

  1、包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。

  2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。

  3、加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

  4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

  5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

  6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

  (二)用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

  用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)，洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌，后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

  四、注意事項(xiàng)

  1.正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

  2.在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

  (1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

  (2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。

  (3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

  (4)酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

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