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公司名稱:上海古朵生物科技有限公司
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六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(鼠兔通用二抗)
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六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(鼠兔通用二抗)
原理介紹: 酪酰胺信號(hào)放大(TSA, Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶( HRP)對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法, 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 , TSA 技術(shù)同樣采 用 HRP 標(biāo)記的二抗, 同樣有對(duì)應(yīng)的 “顯色”步驟 (HRP 催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物, 產(chǎn)生 活化熒光底物, 活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價(jià)結(jié)合, 使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光 素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復(fù)合物, 重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育, 換另一種酪胺熒光素底物, 如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。
TSA 詳細(xì)原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)), 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物, 該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、 組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié) 合, 這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積, 結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到 10-100 倍增強(qiáng)。 簡(jiǎn)單 來說, 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯(lián)熒光素) , 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化, 跟臨近蛋白的酪氨酸殘基 共價(jià)偶聯(lián), 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理, 前一輪非共價(jià) 結(jié)合的抗體被洗掉, 共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。 再換個(gè)一抗來第二輪孵育 , 周而復(fù)始。 等到所有抗體孵育結(jié)束, 熒光素都結(jié)合好后, 后去檢測(cè)結(jié)果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育, 因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng), 以及一抗二抗種屬匹配問題, 大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說, 如果用 TSA 技術(shù), 同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。 本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中以下一種或者多種: TYR-480, TYR-520, TYR- 570, TYR-620, TYR-690, TYR-780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。 可以實(shí)現(xiàn)單標(biāo)、 雙 標(biāo)、 三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能, 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
試劑盒組成: TYR-520 熒光染料(綠光)(即用型, 5mL),-20℃; TYR-570 熒光染料 (紅光) (即用型, 5mL), -20℃; TYR-620 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃; TYR-690 熒光染料 (即用型, 5mL), - 20℃; TYR-780 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃; TSA+增強(qiáng)劑, 100ul, -20℃ (可選) ;
高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (15mL) 4℃ (可選) 。
備注: TYR-520 熒光染料 、TYR-570 熒光染料、 TYR-620 熒光染料、 TYR-690 熒 光染料、 TYR-780 熒光染料 在-20 度下, 均為固體, 使用之前需解凍。
TSA+增強(qiáng)劑使用方法: TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào) 5-10 倍, TSA+增 強(qiáng)劑: TYR 熒光放大液=1:500, 使用 TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng), 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。
操作流程:
1、 石蠟切片脫蠟至水: 依次將切片放入二甲b Ⅰ 15min-二甲bⅡ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風(fēng)廚內(nèi), 酒精晾干后放入自來水中稍洗, 蒸餾水洗。
2、 抗原修復(fù): 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復(fù)液或者 PH6.0 檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù) 盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù) (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復(fù)方法) 。 中火 8min, 停火 8min, 轉(zhuǎn)中低火 7min, 此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā), 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 (修復(fù)液 和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定) 。
3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶: 切片放入 3%過氧化氫溶液, 室溫避光孵育 15 min, 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。
4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) , 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織, 室溫封閉 30min。
5、 加一抗: 輕輕甩掉封閉液, 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X, 切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
6、 加 hrp 二抗: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織, 避光室溫孵育 50min, PBS 洗三次。
7、 熒光染料反應(yīng): TYRXXX 熒光染料反應(yīng) 10-15min, PBS 洗三次。
8、 重復(fù) 2-7 步驟 (換用另外一種 TYRXXX 熒光染料)
9、 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液, 避光室溫孵育 10min。
10、 封片: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。
11、 鏡檢拍照: 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。
染料 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng)
DAPI 藍(lán)色 350 420
TYR-480 450 480
TYR-520 綠色 490 520
TYR-570 紅色 550 570
TYR-620 590 620
TYR-690 630 690
TYR-780 750 780
TSA+增強(qiáng)劑的用法: TSA+增強(qiáng)劑在 4 度或者-20 度是固體狀態(tài), 使用之前需要解凍; 將增強(qiáng)劑按 比例加入到熒光反應(yīng)工作液中, 反應(yīng)信號(hào)提高 5-10 倍, 適用于信號(hào)比較弱的情況, TSA+增強(qiáng)劑不 是一定要加入到熒光反應(yīng)液中, 是可選擇的, 根據(jù)具體情況而定, 具體使用方法: TSA+增強(qiáng)劑: TYR 熒光反應(yīng)液=1:500
文獻(xiàn)引用格式: Co-staining of A, B, C, D and E was performed using a Six-color multiple immunofluorescence Kit ( GuduoBio Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) ba
熒光定量上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。