人骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒使用說明

  本試劑僅供研究使用 標(biāo)本：血清或血漿

  使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本骨形成蛋白6(BMP-6)含量。

  試驗原理：

  BMP-6試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知BMP-6濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將BMP-6和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中BMP-6的濃度呈比例關(guān)系。

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  試劑盒內(nèi)容及其配制

  試劑盒成份(2-8℃保存)96孔配置48孔配置配制

  96/48人份酶標(biāo)板1塊板(96T)半塊板(48T)即用型

  塑料膜板蓋1塊半塊即用型

  標(biāo)準(zhǔn)品：80ng/ml1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按說明書進(jìn)行稀稀

  空白對照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型

  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型

  生物素標(biāo)記的抗BMP-6抗體1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型

  親和鏈酶素-HRP1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型

  洗滌緩沖液1瓶(20ml)1瓶(10ml)按說明書進(jìn)行稀釋

  底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型

  底物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型

  終止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型

  標(biāo)本稀釋液1瓶(12ml)1瓶(6.0ml)即用型

  自備材料

  1. 蒸餾水。

  2. 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

  3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

  安全性

  1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

  2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

  3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

  操作注意事項

  1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

  2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

  3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

  4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

  5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

  6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

  7. 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

  8. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

  9. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

  樣品收集、處理及保存方法

  1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

  2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

  3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

  4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

  5、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

  【骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒】試劑的準(zhǔn)備

  1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

  80 ng/ml(6號標(biāo)準(zhǔn)品)原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

  40 ng/ml(5號標(biāo)準(zhǔn)品)100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  20 ng/ml(4號標(biāo)準(zhǔn)品)100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  10 ng/ml(3號標(biāo)準(zhǔn)品)100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  5.0 ng/ml(2號標(biāo)準(zhǔn)品)100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  2.5 ng/ml(1號標(biāo)準(zhǔn)品)100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

  0 ng/ml(空白對照)原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

  2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

  操作步驟

  1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

  2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

  3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

  4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

  5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

  6. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

  7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

  8. 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

  9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

  建議使用的實驗方案

  標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)

  A8080樣品

  B4040樣品

  C2020樣品品

  D1010樣品

  E5.05.0樣品

  F2.52.5樣品品

  G00樣品樣品

  H樣品樣品

  局限

  6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

  骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒性能

  1. 靈敏度：小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

  2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

  3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

  結(jié)果判斷與分析

  1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

  2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)的BMP-6標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，做得相應(yīng)的曲線，樣品的BMP-6含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

  3、檢測值范圍：0-80ng/ml

  4、敏感度： 0.1 ng/ml

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