小知識(shí)：重組蛋白溶解復(fù)溶緩沖液和載體蛋白

  干粉形式的重組蛋白在常溫下能夠保持穩(wěn)定，大多數(shù) MCE 重組蛋白以干粉形式發(fā)貨。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，這時(shí)候會(huì)?？吹揭晃荒吧质煜さ摹芭笥选薄d體蛋白。

  溶解教學(xué)：

  1: 判斷實(shí)驗(yàn)周期。短期實(shí)驗(yàn)<=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液;長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)>=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液、載體蛋白。

  2: 開(kāi)蓋前離心。凍干粉在運(yùn)輸過(guò)程中，會(huì)因?yàn)橥饬σ蛩卣掣接诠鼙诨蛘吖苌w上，在開(kāi)蓋之前，先通過(guò)離心操作，將凍干粉收集于管底，避免損失和浪費(fèi)。建議 10,000-12,000 rpm 高速離心 30 s;若沒(méi)有高速離心機(jī)，3,000-3,500 rpm 離心 5 min。

  3: 短期實(shí)驗(yàn)：向凍干粉中加入提供的復(fù)溶緩沖液，用槍頭輕輕吹打混勻，重懸至濃度不低于 100 μg/mL。分裝每管不少于 20 μL.

  長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)：先用復(fù)溶緩沖液將蛋白溶解，再用含載體蛋白 (0.1% BSA，5% HSA，10% FBS，或 5% 海藻糖) 的溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)瑵舛炔坏陀?100 μg/mL，然后分裝凍存于 -20°C 至 -80°C。

  為什么重組蛋白要凍干?

  蛋白質(zhì)對(duì)熱非常敏感，蛋白質(zhì)凍干可以使蛋白質(zhì)的大部分活性得以保留，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間，同時(shí)降低運(yùn)輸成本。但凍干可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失部分活性、聚集和其他退化問(wèn)題，需通過(guò)添加保護(hù)劑(穩(wěn)定劑、添加劑、賦形劑) 和控制各種凍干條件以盡可能減少負(fù)面影響。MCE 大部分重組蛋白以?xún)龈煞鄣男问教峁?，室溫下非常穩(wěn)定，支持常溫運(yùn)輸，為確保蛋白質(zhì) 的活性，我們通常以冰袋運(yùn)輸，建議收到產(chǎn)品后 -20℃ 或 -80 ℃ 保存。

  我應(yīng)該如何儲(chǔ)存重組蛋白?

  對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)與載體蛋白 (例如 0.1% BSA、10% FBS、5% HSA 和 5% 海藻糖) 分裝保存，并在 -20°C 至 -80°C 下冷凍保存。在分裝凍存前，建議用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋 (濃度不低于 100 μg/mL)。保存產(chǎn)品時(shí)請(qǐng)避免反復(fù)凍融，每個(gè)冷凍-解凍循環(huán)都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和降解。

  載體蛋白使蛋白保存穩(wěn)定的原理是什么?

  塑料管壁對(duì)蛋白有很強(qiáng)的吸附作用，會(huì)導(dǎo)致重組蛋白粘附在管壁不易分離，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中重組蛋白的實(shí)際濃度偏低，終導(dǎo)致其活性下降。在復(fù)溶重組蛋白時(shí)，加入載體蛋可以預(yù)先封閉塑料管壁上蛋白結(jié)合位點(diǎn)，避免重組蛋白粘附于管壁。此外，載體蛋白也能維持蛋白在低溫條件下的穩(wěn)定，使其保持活性。如果在重組蛋白凍干粉復(fù)溶后，不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)侵苯臃盅b凍存，則溶液中的大部分重組蛋白均會(huì)粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大大降低，終表現(xiàn)為重組蛋白活性的下降。

  含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可以嗎?

  為了維持一定的 pH 值跟鹽類(lèi)濃度，避免蛋白不穩(wěn)定，不建議用水，該溶液通常建議選擇 pH 近中性、有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS、培養(yǎng)基 (RPMI1640, DMEM 等) 等。

  海藻糖 or BSA 怎么選?

  一般情況下，用于細(xì)胞或組織培養(yǎng)可以使用含有 BSA 載體的重組蛋白。但是，當(dāng)進(jìn)行某些實(shí)驗(yàn)，如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、蛋白標(biāo)記時(shí)，BSA 可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)，則不適合使用添加 BSA 的重組蛋白。另外，如果實(shí)驗(yàn)平臺(tái)有特殊要求，也應(yīng)根據(jù)要求選擇不含 BSA 的蛋白。做無(wú)血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有 BSA，F(xiàn)BS 或 HSA 等動(dòng)物或人的蛋白，建議選擇5% 海藻糖作為載體蛋白。

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