植物總DNA的快速少量抽提(CTAB法)@古朵資訊

  實驗目的：

  了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。

  實驗材料及試劑：水稻葉片，1.5×CTAB，/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無水乙醇等

  實驗原理：植物DNA的抽提常采用兩種方法：

  (1)SDS法： 離子去污劑，過程長，純度高;

  (2)CTAB法：該方法簡便、快速，DNA產量高(純度稍次，適用于一般分子生物學操作)。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結合65°C水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復合物，此復合物在高鹽(>0.7mM)濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。經離心棄上清后，CTAB-核酸復合物再用70-75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經過/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化DNA，后經異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來。

  植物總DNA的快速少量抽提實驗步驟：

  1.采集適量幼嫩葉片，用液N2研成粉末，0.4 g裝入1.5ml離心管中(-20℃預冷)。

  2.預熱1.5×CTAB到95℃，加1ml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻(防止凍融)。

  3.立即置于65℃水浴30min，每5分鐘，上下顛倒1次。

  4.12000g離心5分鐘。

  5.吸取上清液約600μl，加入等體積(600μl)/異戊醇(24:1)，上下顛倒數次，至下層液相呈深綠色為止。

  6.12000g離心5分鐘。

  7.取450μl上清于一新1.5ml離心管，加入1ml 95%乙醇和45μl 10M NH4AC)，混勻，室溫放置10min。

  8.12000 g離心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥約30 min。

  9.加入50μl 1/10 TE或無菌水(含20μg/RNase)，置于4℃過夜，待DNA溶解后，檢測DNA濃度及質量。

  植物總DNA的快速少量抽提注意事項：

  1.盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質多，必須用10 mM的β-ME處理

  2.研缽預凍，粉末至加CTAB前不要融化

  3.24:1的/異戊醇抽提時動作應輕柔，轉移用的槍頭好是剪寬了的

  4.所用試劑必需滅菌，手套

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