1、植物天然產(chǎn)物分離純化的意義

廣義而言，任何生物分子都是一種天然產(chǎn)物，但是這一概念通常用來指次生代謝產(chǎn)物(secondarymetabofite)，又稱二次代謝產(chǎn)物，即有機(jī)體所產(chǎn)生的、分子量小于1500的那些小分子。而這些小分子且并非是有機(jī)體生存所必需的，不象為普遍的大分子諸如蛋白質(zhì)、核酸以及多糖等那樣，它們構(gòu)成了生命為基礎(chǔ)過程中的基本結(jié)構(gòu)。植物中的次生代謝產(chǎn)物其分子較小且結(jié)構(gòu)豐富多彩，具有為多變的化學(xué)性質(zhì)，其中不少還具有明顯的生理活性，它們構(gòu)成了植物天然產(chǎn)物研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2、植物天然產(chǎn)物分離純化的策略

要想得到一個(gè)高純度、高產(chǎn)量和低成本的天然藥物有效成分，不僅需要對(duì)各種分離純化技術(shù)全面地了解，也要掌握分離純化的基本策略，在工藝設(shè)計(jì)和優(yōu)化中常常需要考慮純度、回收率、成本和安全性。

(l)純度:目標(biāo)產(chǎn)物的終用途決定了純度的要求，如用于靜脈注射的藥物的純度一般要求達(dá)到99.5%。天然產(chǎn)物提取所達(dá)到的純度與為之所付出的工作量之間常常接近于指數(shù)關(guān)系。從一種復(fù)雜混合物的粗品開始，除去其中不需要的一半以上的雜質(zhì)通常相對(duì)來說比較容易，但要除去其中極少量的雜質(zhì)是非常艱辛和繁瑣的。

僅)回收率:在天然產(chǎn)物的提取中每一步中都會(huì)發(fā)生產(chǎn)物的損失，獲得非常高的純度必然會(huì)損失多的目標(biāo)產(chǎn)物，因此生化工程師必須進(jìn)行過程優(yōu)化以及從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)的放大研究，再考慮純度的同時(shí)應(yīng)盡可能地提高回收率。

(3)成本:分離純化設(shè)備及材料費(fèi)用常常占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的50%一90%。所需純度和提純所需時(shí)間是決定終成本的兩個(gè)關(guān)鍵因素腳l。高純度往往需要較昂貴的提純?cè)O(shè)備或多的提純步驟，造成很高的生產(chǎn)成本。提高分離的效率，減少提純步驟是降低成本的重要途徑。

(4)安全性:一方面，作為藥物的天然產(chǎn)物有效成分必須去除各種墨幽中文有害甚至有毒的成分以及其他能引起副反應(yīng)的雜質(zhì);另一方面，分離過程應(yīng)盡量避免環(huán)境的污染，減少有毒有害溶劑的使用，消除對(duì)人員傷害的可能。

3、植物天然產(chǎn)物分離純化的特點(diǎn)

與一般的分離技術(shù)相比，生化分離技術(shù)有著自身的特點(diǎn)。而植物天然產(chǎn)物的分離不同于那些為普遍的生物大分子的分離，因?yàn)樗麄兊姆肿虞^小，而且與相對(duì)均一的蛋白質(zhì)、核酸以及碳水化合物相比具有為多變的化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)在分離過程中必須予以考慮。到目前為止，植物天然產(chǎn)物分離純化所面臨的難點(diǎn)有:

(l)有效成分的含量低，難于富集。例如抗癌藥物紫衫醇在植物體內(nèi)的含量一般高只有0.06%一0.07%;

(2)分離體系非常復(fù)雜:一方面，植物提取物中的化合物類型眾多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，數(shù)目龐大，可能既有像核酸、蛋白質(zhì)和多糖這樣的大分子，也有黃酮、有機(jī)酸、生物堿、菇類以及無機(jī)鹽等類型的小分子化合物;另一方面，對(duì)同一類型的有效成分，大部分也存在著許多從同一前體代謝得到的結(jié)構(gòu)類似物;

(3)分離過程中的影響因素較多，不同產(chǎn)地、季節(jié)的植物，以及同一植物的不同部位中有效成分的含量和雜質(zhì)的特性也往往不同，另外許多天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，己降解或轉(zhuǎn)化。為解決這些難點(diǎn)，需要利用多個(gè)步驟，不斷變換分離方法，設(shè)計(jì)并實(shí)施高效的生化分離技術(shù)路線，將整個(gè)分離過程的有關(guān)步驟進(jìn)行組合，使之具有簡單，快速，低耗的特點(diǎn)以及良好的操作彈性。

4、分離純化方法的基本原理

分離純化方法的基本原理可以概括為兩類:

(l)利用混合物中不同組分分配系數(shù)的差別，將其分配至兩個(gè)或若干個(gè)物相中，如鹽析、沉淀和萃取等;

(z)將混合物至于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配到不同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如超速離心與超濾技術(shù)等。因此，在選擇一種分離純化技術(shù)之前必須了解目標(biāo)產(chǎn)物的一些理化性質(zhì)(溶解性、極性、帶電性、生物特異性等)，這些性質(zhì)可用來指導(dǎo)分離純化技術(shù)的選擇。

5、分離純化技術(shù)的排序

植物天然產(chǎn)物一般都存在于植物細(xì)胞中，且目標(biāo)產(chǎn)物含量可能非常低;另外由于分離體系中既有與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)差異非常大的雜質(zhì)，也有理化性質(zhì)差別不大的結(jié)構(gòu)類似物，因此很難一步就能純化出目標(biāo)產(chǎn)物。在分離純化過程中，一般要經(jīng)過從植物中浸提，初分離，純化和精致四個(gè)步驟。對(duì)于某些天然產(chǎn)物的純度可能要求不高，僅需要其中的一個(gè)或者兩個(gè)步驟，但大多數(shù)情況下都會(huì)涉及以下這四個(gè)階段:

(l)浸提:浸提的目的是根據(jù)相似相溶原理，將存在于植物細(xì)胞內(nèi)不同位置的產(chǎn)物提取到細(xì)胞外的液相環(huán)境中，同時(shí)可以除去大量的生物質(zhì)如植物的纖維等。提取的步是要通過溶劑或水溶液將小分子的目標(biāo)產(chǎn)物溶出。這可以通過一系列極性順序變化的溶劑提取，也可以通過采用像甲醇這樣的通用溶劑將大部分天然產(chǎn)物溶出的同時(shí)，而且能夠滲入細(xì)胞壁的物理屏障提高其從細(xì)胞質(zhì)中的釋放，然后再經(jīng)過濾或離心除去不溶物。一般的，植物原料須經(jīng)干燥并適當(dāng)粉碎，以增大與溶劑的接觸面積，提高提取效率【例。植物成分中，菇類、幽體等脂環(huán)類及芳香類化合物的極性較小，易溶于、等親脂性溶劑中;而糖貳、氨基酸等類成分則極性較大，易溶于水及含水醇中;至于酸性、堿性及兩性化合物，其溶解度將隨pH值而改變。

(2)初分離:在初分離階段，由于浸出液中物質(zhì)十分復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物的含量低，且在理化性質(zhì)上與目標(biāo)產(chǎn)物相似的雜質(zhì)數(shù)量較多。因此初分離的目的常常是采用多步液一液萃取，吸附層析以及沉淀等分辨率相當(dāng)?shù)偷姆蛛x方法，除去大部分的雜質(zhì)成分，達(dá)到濃縮目標(biāo)產(chǎn)物的目的。初分離產(chǎn)物應(yīng)包含所有感興趣的天然產(chǎn)物而只含有少部分的初提物，體積相對(duì)較少，可用后續(xù)高分辨率提取。在初分離階段選擇分辨率較高的分離方式一般不太合適，因?yàn)楦叻直媛实姆蛛x方法通常是根據(jù)物質(zhì)的兩個(gè)以上的理化性質(zhì)差異而建立起來的，負(fù)荷能力往往都比較小;另外，在雜質(zhì)多的情況下，位點(diǎn)效應(yīng)比較嚴(yán)重，大量的理化性質(zhì)相近的分子在相同的條件下彼此競爭占據(jù)某一位點(diǎn)，因而只能在特定區(qū)域得到一些理化性質(zhì)相近的同類物質(zhì)，使得收集餾分中摻雜大量的類似物，給后續(xù)的純化步驟造成很大的困難。

(3)純化:經(jīng)初分離后，需要采用高分辨率的分離步驟來除去仍舊存在的雜質(zhì)組分。由于這些雜質(zhì)組分與目標(biāo)產(chǎn)物之間存在著某些相似性，因而會(huì)在兩步分離之后依然與目標(biāo)產(chǎn)物共存。盡管初分離所得到的可能只是用于后續(xù)提純的粗餾分，但在純化階段，通過對(duì)分離方法進(jìn)一步加以調(diào)整和改進(jìn)，就可以使分離純化達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。在純化階段，所采用的分離方法需要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)，分子量大小，極性高低，離子電荷性質(zhì)及外界環(huán)境條件的差別等因素來進(jìn)行選擇，而不同的分離方法也總是在特定的條件下才能發(fā)揮佳作用。

(4)精制:這一步通常包括脫色，去除微量雜質(zhì)或熱源，冷凍干燥或者結(jié)晶等。由于這一步產(chǎn)物基本上已經(jīng)很純，且所用的工藝也比較成熟，因此，和前三個(gè)階段相比，這一步相對(duì)來說比較簡單。總之，將各種分離純化手段有機(jī)地進(jìn)行組合，合理地安排分離方法的先后順序，同時(shí)盡可能地實(shí)現(xiàn)各個(gè)步驟之間的偶合，使植物有效成分得到高效快速的分離，這是對(duì)每一個(gè)從事天然產(chǎn)物分離純化工作人員的挑戰(zhàn)。