一、 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及設(shè)備

（一）細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無(wú)菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺(tái)的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無(wú)菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。

1．無(wú)菌操作區(qū)

（1）無(wú)菌操作室：無(wú)菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無(wú)菌操作的區(qū)域，蕞好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。

理想的無(wú)菌操作室應(yīng)劃為三部分：

a) geng衣室—―供geng換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

b) 緩沖間—―位于geng衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無(wú)菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。

c) 無(wú)菌操作間—―專/用于無(wú)菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過(guò)高（不超過(guò)2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無(wú)死角以便清潔和消毒。工作臺(tái)安置不應(yīng)靠墻壁，臺(tái)面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。

無(wú)菌操作間的空氣消毒：

紫外線燈—－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。

空氣過(guò)濾的恒溫恒濕裝置—－蕞好。

表1 潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級(jí)別表

潔凈度級(jí)別 塵粒蕞大允許數(shù)／立方米 微生物蕞大允許數(shù) 浮游菌／立方米 沉降菌／皿

100級(jí) 3,500 0 5 1

10000級(jí) 350,000 2,000 100 3

100000級(jí) 3,500,000 20,000 500 10

300000級(jí) 10,350,000 60,000 - 15

無(wú)臭氧紫外線消毒器

電子消毒滅菌器—－在高壓電場(chǎng)作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的，消毒時(shí)沒(méi)有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30～40min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。

（2）凈化工作臺(tái)：操作簡(jiǎn)單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式 b)外流式或稱水平層流式。

凈化工作臺(tái)工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過(guò)濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過(guò)濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)無(wú)菌區(qū)，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的高潔凈度工作環(huán)境。

側(cè)流式工作臺(tái)—－空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過(guò)工作臺(tái)面流向?qū)?cè)，也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè)，形成氣流屏障保持工作區(qū)無(wú)菌。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為封閉式。

外流式（水平式）工作臺(tái)—－凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對(duì)操作者不利。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為開(kāi)放式（已少用）。

凈化工作臺(tái)應(yīng)用注意：

（1）凈化工作臺(tái)應(yīng)安裝在隔離好的無(wú)菌間或清潔無(wú)塵的房間內(nèi)，以免塵土過(guò)多易使過(guò)濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命。

（2）新安裝的或長(zhǎng)期未使用的工作臺(tái)，工作前必須對(duì)工作臺(tái)和周?chē)h(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理。

（3）使用凈化工作臺(tái)前，應(yīng)先用75％酒精擦洗臺(tái)面，并提前以紫外線滅菌燈照射30～50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。

（4）凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。

（5）注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)酰缇凭珶艋鹧娌粍?dòng)，加大電機(jī)電壓仍未見(jiàn)情況改變則說(shuō)明濾器已被阻塞，應(yīng)及時(shí)geng換。一般情況下，高效過(guò)濾器三年geng換一次。geng換高過(guò)濾器應(yīng)請(qǐng)專業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過(guò)濾器中的過(guò)濾布（無(wú)紡布）應(yīng)定期清洗geng換，時(shí)間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個(gè)月進(jìn)行一次。

（6）凈化工作臺(tái)使用完畢應(yīng)及時(shí)清理工作臺(tái)面上的物品并用酒精擦洗臺(tái)面使之始終保持潔凈。

（7）凈化工作臺(tái)應(yīng)定期進(jìn)行功能測(cè)試，檢查凈化工作臺(tái)各項(xiàng)工作指標(biāo)是否達(dá)到要求，例如進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)，定期檢查臺(tái)面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。

超凈工作臺(tái)的無(wú)菌程度檢查超凈工作臺(tái)在消毒處理后，無(wú)菌試驗(yàn)前及操作過(guò)程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無(wú)菌操作，將平皿半開(kāi)注入溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板，在30～35℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無(wú)菌后將平板3個(gè)，以無(wú)菌方式帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)左、中、右各放一個(gè)；打開(kāi)平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，100級(jí)清潔度要求：3個(gè)平皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過(guò)1個(gè)。

超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門(mén)檢查其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）檢測(cè)塵埃粒徑≤5祄的粒數(shù)不得超過(guò)3.5個(gè)／升；空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s；細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè)，可根據(jù)無(wú)菌狀況必要時(shí)置換過(guò)濾器。

2．孵育區(qū)

本區(qū)對(duì)無(wú)菌的要求雖不比無(wú)菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無(wú)塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來(lái)往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費(fèi)用高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。

3．制備區(qū)

在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。

4．儲(chǔ)藏區(qū)

主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無(wú)菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無(wú)塵。

5．清洗和消毒滅菌區(qū)

清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開(kāi)，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作