是不是在質(zhì)粒提取過程中總會碰到提取的質(zhì)粒濃度不夠或者純度不夠的情況？

其實經(jīng)常提質(zhì)粒之后，會發(fā)現(xiàn)提質(zhì)粒是一項非常簡單且基本的實驗操作。但如果真問起一些質(zhì)粒提取的一些細(xì)節(jié)，可能很多人回答不了。不信隨我看看。

首先，質(zhì)粒的提取可分為質(zhì)粒小提、質(zhì)粒中提、質(zhì)粒大提。目前大多數(shù)實驗室都選用試劑盒方法來提取質(zhì)粒，可以根據(jù)不同的實驗需求，來選擇相應(yīng)的試劑盒。

質(zhì)粒小提主要是對于1ml-5ml的大腸桿菌菌液中質(zhì)粒DNA進行小量提取，獲得的質(zhì)粒用來進行常規(guī)的載體構(gòu)建實驗。

而質(zhì)粒中提，是在質(zhì)粒小提的基礎(chǔ)上進一步去除菌液中的內(nèi)毒素，獲得的質(zhì)粒可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，常規(guī)需要菌液量為10-15ml。

質(zhì)粒大提與中提方法相同，一次可對100ml-200ml菌液進行抽提，從而獲得大量質(zhì)粒。

10大問題，幫您解決在質(zhì)粒提取過程中遇到的zui基本的困惑

1.質(zhì)粒制備的基本原理是什么？

在分子生物學(xué)實驗中，大多數(shù)人都做過質(zhì)粒提取，但并不是所有的人都知道質(zhì)粒制備的基本原則。

堿裂解法是提取質(zhì)粒zui常用的方法。

質(zhì)粒先是被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后挑選單菌落接種到含有特定抗生素的培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)的大腸桿菌達(dá)到生產(chǎn)的平臺期時（一般為12到16個小時），通過高速離心開始收集大腸桿菌；使用試劑盒的懸浮液把菌體全部重懸并用SDS-NaOH進行裂解。

因為SDS是一種很強的去污劑，可以把細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)和磷脂抽提出來，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)得到釋放，而NaOH是強堿，可以讓蛋白質(zhì)、染色體DNA和質(zhì)粒DNA進行變性；當(dāng)菌體徹底裂解了以后，再加入酸性醋酸鉀,用來中和堿性裂解液，同時變性蛋白質(zhì)、變性基因組DNA和細(xì)胞碎片形成沉淀，但是在上清溶液中，存在正確復(fù)性的質(zhì)粒DNA，通過離心，可以收集上清溶液。zui后通過試劑盒的核酸吸附材料，來對上清液中的質(zhì)粒DNA進行回收。

2.質(zhì)粒DNA制備的關(guān)鍵是什么？

使用堿裂解法制備質(zhì)粒的關(guān)鍵是把握好SDS-NaOH處理菌體的時間。

如果質(zhì)粒長時間處于堿性環(huán)境，就有可能出現(xiàn)不可逆的變性反應(yīng)，使得zui終提取出來的質(zhì)粒中含有變性質(zhì)粒。這些變性質(zhì)粒，由于不能進行酶切反應(yīng)，所以無法進行實驗。

3.質(zhì)粒中基因組污染是怎么產(chǎn)生的？

當(dāng)在質(zhì)粒提取過程中變性和中和的步驟處理不當(dāng)時，就會參數(shù)基因組污染。

如果在提取中進行溶液混合時，操作過于劇烈，就會導(dǎo)致基因組DNA被剪切成小片段，zui后在中和時同質(zhì)粒DNA一起復(fù)性保存在上清溶液中，同時被回收出來。

4.如何確定質(zhì)粒小抽細(xì)胞的用量？

對于一般的載體構(gòu)建等常規(guī)實驗，幾微克的DNA就足夠使用了。因此一般小提5ml菌液，都能夠滿足要求。

如果使用過量的細(xì)胞，由于試劑盒的限制，會很難把菌液裂解等，而且DNA的純度和得率并不會顯著提高。所以對于需要大量的質(zhì)粒時，因考慮geng換提取試劑盒或者按比例提高各溶液的用量。

5.電泳分析抽提的質(zhì)粒會看到什么？

如果是制備出來純度非常差的質(zhì)粒，那么從電泳加樣孔往下，您看到的條帶依次是基因組DNA，開環(huán)環(huán)裝質(zhì)粒（opencircularplasmid），超螺旋質(zhì)粒(SuperCoiled)，變性的超螺旋質(zhì)粒（denaturedsupercoiledplasmid），細(xì)菌RNA。

高質(zhì)量質(zhì)粒膠圖主要部分為超螺旋質(zhì)粒，沒有RNA等的污染。

6.質(zhì)粒制備的得率是由哪些因素決定的？

屬主細(xì)胞類型、大腸桿菌的數(shù)量、質(zhì)粒的拷貝數(shù)和提取過程中使用純化方式（試劑盒類型）。

7.您的質(zhì)粒需要什么樣的純度？

同樣對于一般的載體構(gòu)建等常規(guī)實驗和送去測序檢測的話，用手工和試劑盒制備的DNA都能達(dá)到要求。

如果是質(zhì)粒需要用來做細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的話，則需要無熱源，無內(nèi)毒素（LPS）。

8.為什么酶切鑒定“有插入片段”的

質(zhì)粒測序卻發(fā)現(xiàn)是空的？

產(chǎn)生這種現(xiàn)象的zui主要的原因是提取質(zhì)粒的過程中產(chǎn)生了變性的超螺旋質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶無法對它進行酶切。所以在判斷酶切效果時通過電泳進行分析，變性的超螺旋質(zhì)粒常常被誤認(rèn)為是酶切下來的片段，導(dǎo)致誤判。其實只需要在酶切后的電泳分析增加一個原始質(zhì)粒進行對照就可以避免誤判。

9.如何判定DNA的純度和濃度？

使用試劑盒抽提的質(zhì)粒DNA，可以通過儀器檢測OD260和OD280濃度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之間。估算質(zhì)粒濃度可以通過瓊脂糖電泳來判斷會geng準(zhǔn)確一些。

10.為什么有些純化的質(zhì)粒時間長了會發(fā)生降解？

如何解決？

產(chǎn)生這個問題的原因有很多，主要還是因為核酸酶的污染。

除了在質(zhì)粒提取過程中會帶入核酸酶外，根據(jù)有關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒屬主細(xì)胞的種類也會影響到抽提質(zhì)粒的質(zhì)量。如果提取的質(zhì)粒需要長期保存，可以使用內(nèi)含豐富的核酸酶活性的大腸桿菌，比如DH5α,DH1,HB101等