近幾十年來(lái)，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)從zui早的用熒光素作標(biāo)記物的免疫熒光技術(shù)（IF）到后來(lái)用同位素作標(biāo)記物的免疫放射技術(shù)（RIA）再到現(xiàn)在利用酶作為標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA），其發(fā)展趨勢(shì)越來(lái)越成熟。ELISA因具有靈敏度高、放大能力強(qiáng)、穩(wěn)定、安全等綜合，迅速成為學(xué)術(shù)界炙手可熱的研究工具。今天，我們就來(lái)看看，要獲得一個(gè)高質(zhì)量的ELISA需要具備些什么條件！

    一、技術(shù)原理及步驟

    ELISA原理大致為將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原-抗體反應(yīng)在固相表面，而后加入的顯色劑在酶的催化下使結(jié)合物顯色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量。

    在實(shí)際應(yīng)用中，因目的抗原或抗體制備方式、標(biāo)記方式等因素，使ELISA方法步驟可分為多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

    二、臨床標(biāo)本的收集和保存

    用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿）。本實(shí)驗(yàn)室用ELISA測(cè)定乙肝兩對(duì)半，甲肝，戊肝，抗HIV的標(biāo)本時(shí)，在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

   1、要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時(shí)，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的活性，顯色時(shí)可能造成假陽(yáng)性。

    2、標(biāo)本凝固不全強(qiáng)行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

    3、血清標(biāo)本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長(zhǎng)時(shí)間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融，標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

    三、ELISA測(cè)定中試劑準(zhǔn)備

    在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來(lái)直接做實(shí)驗(yàn)會(huì)造成一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因?yàn)樵诤竺娴姆跤磻?yīng)步驟中，造成孵育時(shí)間不夠。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

    四、加血清樣本及反應(yīng)試劑

    血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn)：

    1、加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時(shí)，加樣槍需按到di一檔，加樣時(shí)，加樣槍需直接按到底。

    2、加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡。

    3、反應(yīng)試劑的加入時(shí)先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

    五、溫育的時(shí)間與溫度

    溫育是ELISA測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時(shí)間應(yīng)按照試劑說(shuō)明書(shū)上的時(shí)間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實(shí)際測(cè)定操作中要注意以下幾點(diǎn)：

    1、要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)。

    2、因?yàn)椴捎盟?，所以在溫育時(shí)一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染，并有可能整板花板。

    六、ELISA測(cè)定的洗板

    全自動(dòng)洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

    1、洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶

    2、在自檢過(guò)程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

    3、在洗板過(guò)程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無(wú)外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時(shí)間。

    七、ELISA測(cè)定以TMB為底物的顯色

    加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，zui好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，zui后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定判斷結(jié)果。在此過(guò)程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實(shí)驗(yàn)。

    八、ELISA的比色測(cè)定

    ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，故需強(qiáng)調(diào)比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否是雙波長(zhǎng)（450nm和630nm）。

    九、ELISA測(cè)定結(jié)果判定

    結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過(guò)程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽(yáng)的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見(jiàn)的模式（如乙肝兩對(duì)半中出現(xiàn)12陽(yáng)性等），需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，重新復(fù)查。

    對(duì)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因（非試劑盒本身的原因），總結(jié)如下：

    1、弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題。

    2、測(cè)定的重復(fù)性差，這是由于測(cè)定操作引起的問(wèn)題，包括：

    ①加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致

    ②加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染

    ③加錯(cuò)樣本

    ④加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁

    ⑤不同批號(hào)試劑盒中組分混用

    ⑥溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致

    ⑦孔內(nèi)污染雜物

    血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。

    3、全部孔都不顯色

    ①漏加酶結(jié)合物；

    ②洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題

    ③漏加顯色劑A或B

    ④終止劑當(dāng)顯色劑使用

    4、全部板孔均有顯色

    ①板不干凈

    ②顯色液變質(zhì)

    ③洗板液受酶等污染

 

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