經(jīng)常提質(zhì)粒嗎？熟練之后，提質(zhì)粒乃至質(zhì)粒構(gòu)建都很簡單。但如果真問起一些質(zhì)粒的細(xì)節(jié)，可能很多人回答不了。不信隨我看看。

質(zhì)粒組成要素

一個合格的質(zhì)粒含有以下組成部分：

復(fù)制起始位點 Ori 即控制復(fù)制起始的位點。原核生物 DNA 分子中只有一個復(fù)制起始點。而真核生物 DNA 分子有多個復(fù)制起始位點。

抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+ 、Kan+。

多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段

P/E 啟動子/增強(qiáng)子

Terms 終止信號

加 poly（A）信號 可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用

如何閱讀質(zhì)粒圖譜

一步：先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（長那霉素衍生物）失活

hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號

啟動子－促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 順序，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。

為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

如何選擇載體

把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

P.S. 基因工程所用的 vector 實際上是 DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA。

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。

載體選擇主要考慮下述 3 點：

1. 構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

2. 載體的類型：

克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。?。如<10kb 選質(zhì)粒。

表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。

對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3 點：選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時注意克服 4 個困難和閱讀框錯位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

3. 載體 MCS 中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。

選用質(zhì)粒（常用）做載體的 4 點要求：

選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5 kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 < 10 個。

必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

無論選用哪種載體，先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。